AG Nicke

Leitung

Prof. Dr. phil. nat. Annette Nicke

Forschung

• Struktur und molekulare Funktion von P2X-Rezeptoren und anderen Ionenkanälen
• Physiologische und pathophysiologische Funktionen von P2X7-Rezeptoren
• P2X7-Rezeptor-Signalübertragung
• Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Peptidtoxinen

Adenosin-5'-triphosphat (ATP) ist ein wesentliches Molekül für alle Lebensformen. Es ist nicht nur eine Hauptenergiequelle und Bestandteil von Nukleinsäuren innerhalb der Zelle, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle als extrazelluläres Signalmolekül, das die schnelle und langsame Kommunikation zwischen Zellen vermittelt. Metabotrope P2Y- oder ionotrope P2X-Rezeptoren (Illes et al. 2021) für ATP und seine Metaboliten wurden in allen Geweben von Säugetieren identifiziert. Der purinerge P2X7-Rezeptor-Subtyp ist an proinflammatorischen Prozessen beteiligt und stellt ein vielversprechendes Ziel für Medikamente dar (Kaczmarek-Hájek et al. 2012). Seine Aktivierung löst verschiedene zelluläre Reaktionen aus, wie z. B. die Bildung großer Membranporen, Veränderungen in der Zusammensetzung und Morphologie der Plasmamembran, Ablösung der Ektodomäne, Freisetzung von Zytokinen, Apoptose und Induktion der Gentranskription. Die zugrundeliegenden Signalwege sind nur unzureichend verstanden, stehen aber mit einer großen intrazellulären Domäne in Verbindung, die bei anderen Mitgliedern der P2X-Familie nicht zu finden ist (Kopp, Durner et al. 2019) und keine Homologie zu bekannten Proteinen aufweist. Ein kürzlich erzielter Durchbruch war die Bestimmung der Kryo-EM-Struktur des P2X7-Rezeptors der Ratte in voller Länge, die ein unerwartetes neues GTP/GDP-Bindungsmotiv und eine zweikernige Zn2+-Bindungsstelle in der intrazellulären Domäne ergab.
Übersetzt mit DeepL.com (kostenlose Version)

Aktuelle Projekte

1) P2X-Rezeptoren (P2XRs) sind ATP-aktivierte, Ca2+-permeable Kationenkanäle. Wir haben bereits ihre trimere Struktur bestimmt (Nicke et al. 1998) und die ATP-Bindungsstelle an der Schnittstelle zwischen benachbarten P2X-Untereinheiten lokalisiert (Marquez-Klaka et al. 2007). Neuere Arbeiten konzentrieren sich auf die molekularen Funktionen des P2X7-Rezeptors und seines rätselhaften C-terminalen Schwanzes. Zur Untersuchung der molekularen Bewegungen, die mit der Kanalaktivierung einhergehen, verwenden wir die Spannungsklemmen-Fluorimetrie. Wir haben kürzlich die Einführung einer fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäure (UAA) in Proteine optimiert, die in Xenopus laevis exprimiert werden, und einen Aufbau zur Analyse molekularer Interaktionen und Dynamiken durch Spannungsklemmen-Fluorometrie (VCF)/Ca2+-Bildgebung mit zwei Wellenlängen eingerichtet (Durner et al. 2013; Lörinczi et al. 2012).

2) Um die physiologischen und pathophysiologischen Funktionen des P2X7-Rezeptors besser zu verstehen, haben wir ein transgenes bakterielles künstliches Chromosom (BAC) Reportermausmodell entwickelt und validiert, in dem ein fluoreszenzmarkierter P2X7-Rezeptor (P2X7-EGFP) unter der Kontrolle des endogenen P2X7-Promotors mäßig überexprimiert wird. Dieses Mausmodell ermöglicht die Visualisierung und Bestimmung der zelltypspezifischen und subzellulären P2X7-Lokalisation (Kaczmarek-Hájek, Zhang, Kopp et al. 2018; Ramírez-Fernández et al. 2019; Jooss, Zhang et al. 2023). Darüber hinaus untersuchen wir die Folgen der veränderten Rezeptorfunktion, indem wir diese P2X7 überexprimierenden Mäuse mit P2X7 ko-Mausmodellen vergleichen.

3) Um die P2X7-Signalübertragung zu untersuchen, führten wir eine in situ-Vernetzung und eine anschließende massenspektrometrische Analyse der gereinigten P2X7-EGFP-Komplexe durch. Dabei haben wir einige zuvor gefundene P2X7-Interaktionspartner bestätigt und eine Reihe neuer potenzieller Interaktoren identifiziert, von denen die meisten eine vermutete Immunfunktion haben. Diese werden derzeit weiter validiert.

4) In mehreren weiteren Projekten identifizieren wir neuartige α-Conotoxine, kleine Peptide aus dem Gift von Meeresschnecken (Dutertre, Nicke und Tsetlin 2017), und untersuchen deren Subtyp-Selektivität und Struktur-Funktionsbeziehungen. Ziel dieser Arbeit ist es, optimierte selektive Peptidliganden als pharmakologische Weraaakzeuge für die Subtyp-Differenzierung von nAChRs zu entwickeln und Rezeptor-Ligand-Interaktionen besser zu verstehen. Bisher haben wir verschiedene neuartige Peptide isoliert und Beziehungen zwischen ihrer Sequenz und ihren posttranslationalen Modifikationen sowie ihrer Potenz und Selektivität ermittelt (z. B. Nicke et al. J. Biol. Chem. 2003, Loughnan et al 2006). Durch rationale Mutagenese auf der Grundlage computergestützter Docking-Studien konnten wir Aminosäurereste identifizieren, die zu den spezifischen Interaktionen mit α-conotoxins beitragen (Dutertre et al. 2008; Beissner et al. 2012; Leffler et al. 2017, Haufe et al 2023).

Methoden

• Proteinbiochemie (z. B. Vernetzungsmassenspektrometrie, BN-PAGE-Analyse)
• Molekularbiologie (Mutagenese und Einführung von unnatürlichen Aminosäuren)
• Funktionsanalyse von Ionenkanälen (Uptake-Messungen, 2-Elektroden-Voltage-Clamp, Patch-Clamp, Voltage-Clamp-Fluorimetrie)
• Erzeugung und Charakterisierung von transgenen Mäusen (Immunfluoreszenzfärbung, konfokale Mikroskopie)